Gene targeting e embriologia sperimentale 

(Dr. Nicola Russo e Dr. Luca Roberto)

- Modelli Cellulari Geneticamente Modificati

I modelli cellulari geneticamente modificati sono strumenti cruciali nella ricerca scientifica, utilizzati per comprendere meglio le funzioni dei geni e il loro ruolo nelle malattie umane. Questi modelli vengono creati alterando specificamente il DNA delle cellule attraverso tecniche come il CRISPR/Cas9, il gene targeting o la trasfezione di vettori virali. Le modifiche possono includere l'inserimento, la rimozione o la mutazione di geni, permettendo ai ricercatori di analizzare come queste variazioni influenzino i processi cellulari, come la proliferazione, la differenziazione e la risposta a stimoli esterni. I modelli cellulari geneticamente modificati sono essenziali per studiare malattie complesse, sviluppare nuovi trattamenti e testare l'efficacia di farmaci in un ambiente controllato. Questi modelli offrono un sistema altamente specifico e riproducibile, contribuendo a ridurre l'uso di modelli animali e a promuovere un approccio più etico nella ricerca biomedica.

Di cosa si occupa il service 

Biogem offre una generazione personalizzata di qualità di modelli cellulari utilizzando tecnologie avanzate di biologia molecolare.

Lista dei servizi:

• Progettazione di una strategia mirata
• Costruzione di un vettore mirato
• Elettroporazione, trafezione e infezione di linee cellulari murine e umane
• Selezione, validazione e sequenziamento delle modifiche geniche inserite

Tipi di modelli cellulari:

Linee Cellulari over-esprimenti un gene

Linee Cellulari over-esprimenti geni mutati

Linee cellulari knock-out con sistema Crispr/Cas9 

Linee cellulari knock-in con sistema Crispr/Cas9 

Linee cellulari reporter

Linee cellulari immortalizzate

- Modelli Murini Geneticamente Modificati

I modelli murini geneticamente modificati sono strumenti essenziali per la ricerca biomedica, poiché consentono di studiare le funzioni di specifici geni e il loro ruolo in malattie umane. Questi modelli vengono creati alterando il DNA dei topi tramite tecniche come il gene targeting o l'editing genomico sfruttando la ricombinazione omologa nelle cellule embrionali staminali (ES). Le modifiche genetiche possono includere l'inserimento, la rimozione o la mutazione di geni specifici, permettendo ai ricercatori di osservare gli effetti biologici di tali alterazioni. Questi topi geneticamente modificati sono cruciali per comprendere i meccanismi di patologie complesse come il cancro, le malattie neurodegenerative e le malattie genetiche rare. Inoltre, servono come piattaforme per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi farmaci e terapie geniche, accelerando il progresso della medicina personalizzata. Grazie alla loro rilevanza, i modelli murini geneticamente modificati sono diventati uno standard nelle ricerche precliniche e rappresentano un ponte tra la ricerca di base e le applicazioni cliniche.

Di cosa si occupa il service 

Biogem offre una generazione personalizzata di qualità di modelli murini utilizzando tecnologie avanzate di biologia molecolare.

Lista dei servizi:

• Progettazione di una strategia mirata
• Stesura del progetto per autorizzazione ministeriale
• Costruzione di un vettore mirato
• Elettroporazione di cellule staminali embrionali (ES) di topo
• Valutazione di cellule ES per ricombinazione omologa
• Generazione di topi chimerici mediante iniezione di morula o blastocisti
• Import e utilizzo di cloni di ES ottenuti da consorzi come KOMP a EUCOMM
• Valutazione della trasmissione germinale
• Allevamento di topi chimerici per eterozigosità
• Import e allevamento di linee murine geneticamente modificate da distributori internazionali
• Riderivazione delle linee acquisite
• Sperm freezing delle linee generate e acquisite

Tipi di modelli murini:

Knock out costitutivo

Un topo knockout costitutivo è un modello genetico in cui un gene specifico è permanentemente disattivato in tutte le cellule dell'organismo, dalla nascita fino alla morte. Questo modello viene utilizzato per studiare le funzioni essenziali del gene in condizioni normali e patologiche. 

Knock out condizionale

Un topo knockout condizionale è un modello genetico in cui un gene specifico può essere disattivato in modo controllato, solitamente in un tessuto specifico o in un determinato stadio di sviluppo, permettendo uno studio più preciso della funzione genica.

Mutazione puntiforme costitutiva/condizionale

Un topo con mutazione puntiforme è un modello genetico in cui una singola base del DNA è stata modificata per alterare un gene specifico. Questo permette di studiare gli effetti precisi di quella mutazione, utile per comprendere malattie genetiche e sviluppare terapie mirate

Knock in Rosa26

Il topo knock-in Rosa26 è un modello genetico in cui un gene esogeno viene inserito in un locus specifico (Rosa26) del genoma murino. Questo sito è comunemente utilizzato per esprimere in modo stabile e uniforme i transgeni, facilitando lo studio di geni esogeni o modificati..

Topi Umanizzati

L’umanizzazione, basata sull’approccio knock in, permette di testare in vivo composti e anticorpi verso proteine umane nel topo. Questo è ottenuto tramite la sostituzione del gene murino con la controparte umana, inserendo il gene nello stesso contesto trascrizionale del gene murino.

Topi Reporter

Un topo reporter è un modello genetico in cui un gene specifico è sostituito o associato a un marcatore visibile, come una proteina fluorescente, per monitorare l'espressione genica o l'attività cellulare in vivo.

Topi Cre

Un topo Cre è un modello murino geneticamente modificato che esprime l'enzima Cre ricombinasi, il quale permette di attivare o disattivare specifici geni in tessuti o stadi di sviluppo selezionati. Questo sistema è utilizzato per studiare funzioni geniche in modo controllato e preciso.

Acquacoltura Zebrafish (Dr.ssa Carla Reale)

Lo zebrafish (Danio Rerio) è il principale organismo modello vertebrato, non appartenente alla classe dei mammiferi il cui utilizzo si è imposto inizialmente nello studio della biologia dello sviluppo e successivamente di diverse malattie umane, incluso il cancro, così come nella valutazione della tossicità di diverse molecole. Il suo successo è dovuto alla possibilità di poterlo utilizzare nello studio di processi complessi quali quelli legati all’organogenesi. Nel campo dell’oncologia è attualmente molto diffuso l’utilizzo di larve zebrafish per monitorare la capacità invasiva, metastatica e proliferativa delle cellule tumorali umane (modelli xenograft).

Di cosa si occupa il service ed il suo stabulario

Lo stabulario Zebrafish di Biogem è dotato di sistemi di allevamento all’avanguardia e tecnologicamente avanzati (sistema Stand Alone) che garantiscono il massimo benessere animale, assicurando mantenimento dei parametri acquatici ottimali e il ciclo giorno/notte, oltre che la strumentazione adatta all’analisi microscopica delle larve. La facility ospita diverse linee modello generate per lo studio di diverse patologie umane e linee reporter che consentono di visualizzare, tramite fluorescenza, diverse popolazioni cellulari nell'animale fin dai primi stadi di vita.

Il service zebrafish di Biogem, si occupa principalmente:

• della generazione di modelli in vivo geneticamente modificati per lo studio di diverse patologie umane;
• della generazione di modelli xenograft per lo studio di diversi tipi di tumore;
• dello screening di molecole per valutarne l’effetto tossicologico o antitumorale. 

• definizione della strategia di targeting
• stesura del progetto ministeriale
• injection per transgenesi, knockout costitutivi e condizionali, over-espressione (CRISPR/Cas9 system)
• caratterizzazione fenotipica del modello
• sperm freezing delle linee generate
• in vitrofertilization (IVF) 

Oltre a generare modelli geneticamente modificati per la ricerca oncologica  ci occupiamo della generazione e dell'analisi di modelli xenograft per la valutazione dell’efficacia di diversi farmaci in larva e in adulto (a tal scopo disponiamo di una linea fli1:GFP che marca i vasi sanguigni e di una linea adulta immunodepressa):

• Cell Derived Xenograft (CDX) e Patient Derived Xenograft (PDX)
• analisi microscopica ad alta risoluzione (microscopio confocale e 2-fotoni)
• analisi dei dati ottenuti

Inoltre, forniamo supporto per in vivo high-throughput  screening di molecole per:

• una rapida caratterizzazione degli effetti in termini dei meccanismi di azione e citotossicità
• determinare la tossicità specifica di molecole in linee reporter
• testare l'effetto di terapie anti-cancer sulla progressione tumorale e l'invasione metastatica