Nefrologia traslazionale

    Responsabile Prof. Giovambattista Capasso

    Aree di ricerca
    L’obiettivo del laboratorio di Nefrologia Traslazionale è approfondire la conoscenza della fisiopatologia renale, in modo da sviluppare, successivamente, nuovi target terapeutici. Gli attuali interessi di ricerca del nostro laboratorio sono indirizzati allo studio dell’ipertensione arteriosa, del diabete mellito, del diabete insipido, delle sindromi poliuriche, della tossicità renale dei farmaci, delle malattie cistiche renali e dei modelli di insufficienza renale acuta, nonché delle patologie renali rare. Nel laboratorio di Nefrologia Traslazionale vengono utilizzati sia modelli animali geneticamente modificati, in cui vengono riprodotti la patologia renale o le sue alterazioni, sia modelli murini, in cui viene indotto lo stato patologico, grazie all’utilizzo di sostanze nefrotossiche. Tali modelli animali rappresentano un valido strumento per riprodurre e studiare le patologie renali, permettendo cosi lo sviluppo di molecole ad azione farmaceutica che, in caso favorevole, potranno essere utilizzate in campo umano.
    • Tecnologie utilizzate/sviluppate
      Per poter raggiungere gli obiettivi sopra menzionati vengono utilizzati studi in vivo e in vitro.
    • Parametri metabolici di base: topi o ratti vengono posti individualmente in gabbie metaboliche che permettono, dopo tre giorni di adattamento, di monitorare il consumo di acqua e cibo, la misurazione di elettroliti (Na, Cl, Ca, K, Mg) e proteinuria, in seguito a prelievo di urina e di ematocrito, e di metaboliti ematici (pH, pO2, pCO2, HCO3), in seguito a prelievo di sangue arterioso o venoso.
    • Valutazione istologica della morfologia renale: reni di topo o di ratto vengono raccolti in seguito a perfusione renale con paraformaldeide, tramite aorta addominale. Successivamente vengono inclusi in paraffina e tagliati in sezioni sottili per la valutazione morfologica dell’organo o dell’espressione di alcune proteine, attraverso saggi di immunoistochimica.
    • Dissezione macroscopica e microscopica dei distretti renali: una volta raccolti, i reni vengono decapsulati e dissezionati, in modo da ottenere una porzione di corticale, una di midollare esterna e una di midollare interna. I differenti segmenti del nefrone (glomerulo, tubulo prossimale, ansa di henle, tubulo distale e dotto collettore) possono essere isolati, digerendo la porzione renale di interesse con una soluzione contenente collagenasi e proteinasi. I tubuli renali, cosi isolati, permettono una efficiente estrazione di RNA e proteine.
    • Micropuntura renale: è una metodica altamente specializzata, che consente la valutazione del flusso renale direttamente nelle singole porzioni del nefrone. Grazie all’utilizzo di micropipette viene iniettato un liquido di perfusione, a monte del tubulo di interesse. Tale liquido viene poi raccolto a valle del segmento renale e analizzato. In questo modo si ottengono informazioni sul flusso renale del tubulo studiato, sull’entità di assorbimento e di secrezione, nonché sui meccanismi indotti da eventuali farmaci iniettati.
    • Microscopia a due fotoni: è la tecnica d’elezione per studi di fisiopatologia in organi di animali viventi, a livello cellulare e sub-cellulare, che consente un’acquisizione simultanea, in tempo reale, di diversi parametri fisiologici. In campo nefrologico, la microscopia a due fotoni permette di approfondire la conoscenza di molte patologie, tra cui l’insufficienza renale acuta, l’ipertensione, o il diabete mellito, grazie alla possibilità di utilizzare sonde fluorescenti che permettono continue misurazioni in tempo reale. In seguito alla esternalizzazione del rene, l’animale viene posizionato sotto al microscopio a due fotoni e i compartimenti renali di interesse vengono marcati tramite accesso venoso, con specifiche sonde fluorescenti. L’analisi degli eventi cellulari, registrati in condizioni normali o di patologia, può essere effettuata tramite approcci informatici.
    Principali risultati conseguiti
    • Cistogenesi in un modello murino cKO per Dicer nel rene in toto
      L’inattivazione di Dicer nel modello murino cKO (Dicerflox/flox; Pax8Cre/+) causa un’alterata biogenesi dei miRNA a livello renale e tiroideo, determinando la formazione di numerose cisti e fibrosi interstiziale nei reni di cKO a due mesi. Dal punto di vista funzionale i cKO manifestano un marcato difetto di concentrazione dell’urina e proteinuria. La formazione delle cisti è correlata ad una graduale scomparsa del cilio primario e si associa ad una alterazione del pathway GSK3β/β-catenina.
    • β1 integrina è fondamentale per il processo di concentrazione delle urine. Per studiare la β1 integrina, un recettore che media l’interazione tra cellula e matrice extracellulare, è stato generato un modello murino cKO (Itgb1flox/flox; Pax8 Cre/+) in cui la proteina è deleta in tutto il nefrone. I reni dei topi cKO manifestano marcata idronefrosi e dilatazioni dei tubuli distali, dell’ansa di Henle e dei dotti collettori. Abbiamo inoltre identificato, in questi animali, una riduzione di espressione del canale AQP2, che ha determinato un forte difetto di concentrazione delle urine.
    • miRNA: targets terapeutici per acquaresi. Per indagare il ruolo dei miRNA nei dotti collettori è stato generato un modello murino cKO in cui si ha delezione specifica di Dicer nelle cellule principali (Dicerflox/flox; AQP2+/Cre). In questa porzione del nefrone il canale dell’acqua AQP2 media il processo di concentrazione delle urine, al punto che assenza o mutazioni di questa proteina causano diabete insipido. Abbiamo evidenziato una marcata poliuria in topi cKO di circa due mesi, sviluppo di idronefrosi e morte prematura entro i tre mesi. È in corso la definizione di nuovi target molecolari in questo processo.
    • Plasticità cellulare del dotto collettore come meccanismo di auto-riparazione. Le cellule principali (PC) e quelle intercalate (IC) costituiscono i due tipi cellulari del dotto collettore, e hanno origine da precursori staminali non ben noti. Le cellule intercalate possono mutare il loro assetto da acido a base secretivo, mostrando estrema plasticità. Dalla letteratura si evince che le cellule principali possono invece mutare in cellule intercalate. Abbiamo dimostrato precedentemente che il litio induce la comparsa di tipi cellulari aventi caratteristiche intermedie tra PC e IC. Abbiamo generato topi esprimenti selettivamente YFP nelle PC per seguirne i cambiamenti morfologici e funzionali durante il trattamento con litio. L’eventuale espressione di marcatori propri delle IC nelle cellule YFP marcate proverebbe l’eventuale conversione delle PC in IC.
    • Nuovi target molecolari di ipertensione in un modello di ipertensione sale sensibile (ratti NA). Polimorfismi dell’alpha adducina sono legati allo sviluppo di ipertensione arteriosa nell’uomo. Stiamo determinando il meccanismo patogenetico che determina lo sviluppo di ipertensione arteriosa in ratti portatori di una mutazione dell’alpha adducina. Da esperimenti preliminari è nota una interazione molecolare tra alpha adducina e il trasportatore Na/Cl tiazide sensibile (NCC). Tale interazione modifica lo stato di fosforilazione e di attivazione di NCC.
    • Applicazione di metodiche molecolari nella diagnostica di patologie genetiche rare. Stiamo studiando diverse malattie genetiche rare, tra cui la sindrome di Fanconi Bickel, la sindrome di Gitelman e la β-talassemia. In particolare, utilizziamo un approccio molecolare innovativo per la validazione di possibili marcatori prognostici su campioni di urine di pazienti affetti.

    Seminario interno

    YOKO SUZUMOTO PhD, 'Characterization of renal Paraoxonase 2 (PON2)'
    YOKO SUZUMOTO PhD, 'Characterization of renal Paraoxonase 2 (PON2)' Lunedì 20 Settembre 2021
    La Paraoxonasi 2 (PON2) è un enzima associato alla membrana che possiede un’elevata attività idrolitica contro la molecola di segnalazione batterica 3-oxo-C12 omoserina lattone, con conseguente difesa contro batteri patogeni come Pseudomonas aeruginosa. Inoltre, PON2 mostra una funzione di ossidoriduzione consentendo la prevenzione dell’aterosclerosi. Molti dati scientifici suggeriscono il coinvolgimento di PON2 in diverse malattie umane come il diabete mellito, la malattia di Alzheimer e il cancro del pancreas. In particolare, una recente ricerca ha dimostrato il potenziale coinvolgimento di PON2 nella patogenesi del tromboembolismo venoso nei pazienti affetti da COVID-19. In questo studio, sono stati approfonditi i meccanismi regolatori e i potenziali ruoli dell’enzima PON2 renale, utilizzando sistemi sia in vivo che in vitro. Nel ceppo di ratti normotesi Milano, in condizioni di alto aldosterone indotto da una dieta a basso contenuto di sodio, PON2 risulta up-regolato in parallelo con l’attivazione proteolitica dell’alfa-ENaC nella corteccia renale. Questi meccanismi avvengono mediante l’attivazione del recettore dei mineralcorticoidi, poiché lo spironolattone che è antagonista dell’aldosterone, blocca sia l’attivazione di ENaC che l’up-regolazione di PON2. Inoltre, è stato dimostrato che lo spironolattone e il canrenone inibiscono l’attività della lattonasi PON2 in vitro. Infine, l’up-regolazione di PON2 indotta dall’aldosterone è associata a livelli ridotti di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella corteccia renale, in particolare i livelli di superossido. Questi risultati indicano l’ormone aldosterone come un nuovo regolatore di PON2 nel rene e suggeriscono che PON2 potrebbe preservare il rene dai danni correlati ai ROS indotti dall’aldosterone, come la fibrosi, mediante la modulazione dei livelli di ROS.
    VINCENZO COSTANZO PhD, In vivo evaluation of renal function using intravital multiphoton microscopy
    VINCENZO COSTANZO PhD, In vivo evaluation of renal function using intravital multiphoton microscopyLunedì 27 Settembre 2021
    La microscopia a 2 fotoni (2PM) rappresenta la tecnica “gold standard” per effettuare studi di fisiopatologia renale in vivo. Infatti, rispetto alle precedenti metodiche, la 2PM offre una maggiore penetrazione del laser nei tessuti grazie alla minore dispersione della luce, una minore foto-tossicità che permette di monitorare continuamente nel tempo i campioni studiati ed una minore perdita di fluorescenza. A Biogem è stato realizzato un laboratorio di 2PM grazie alla generosa donazione della fondazione “Terzo Pilastro Internazionale”, presieduta dal Prof. Emmanuele F.M. Emanuele. In questo studio ci siamo focalizzati principalmente su 3 grandi progetti di ricerca: lo studio della funzione glomerulare attraverso la misurazione del single nephron glomerular filtration rate (SNGFR), lo studio della funzione tubulare mediante la valutazione del riassorbimento di glucosio e di proteine nel tubulo prossimale, e la rilevazione e quantificazione della fibrosi renale in vivo ed ex vivo. Nel laboratorio di Nefrologia Traslazionale è stato messo a punto un approccio innovativo per misurare in vivo il SNGFR, che rappresenta uno dei più importanti parametri renali in grado di dare informazioni precise ed in tempo reale sulla funzione renale. Tale approccio, validato in modelli sperimentali di insufficienza renale acuta, garantisce grande precisione e affidabilità nelle misurazioni offrendo risultati comparabili alle precedenti metodiche. Per gli studi di funzionalità tubulare, in particolare il riassorbimento di glucosio nei tubuli renali prossimali, è stato utilizzato un modello murino GLUT2 cko che mima la sindrome di Fanconi Bickel, una patologia genetica caratterizzata da accumulo di glucosio epato-renale, alterato metabolismo di glucosio e galattosio, e disfunzione del tubulo prossimale. Grazie alla 2PM è stato possibile dimostrare in vivo che i topi GLUT2 cko hanno un alterato meccanismo di riassorbimento del glucosio rispetto al gruppo controllo. Infine, è stato possibile sviluppare un approccio per rilevare e quantificare la fibrosi renale sia in modelli animali che in sezioni tissutali. Questo è possibile sfruttando il fenomeno ottico della “second harmonic generation” (SHG), proprietà intrinseca della 2PM, che consente di rilevare naturalmente e senza nessuna marcatura esogena specifiche molecole tissutali, come le fibre di collagene e la miosina. Tale metodica garantisce elevata specificità e permette di eliminare la variabilità tipica delle tradizionali metodiche istologiche di colorazione. La SHG accoppiata a software di machine learning è in grado di effettuare classificazione di immagini e rappresenta un valido strumento per quantificare la fibrosi renale, non solo nei modelli animali ma anche per la pratica clinica routinaria. Gli approcci di microscopia messi a punto in questo progetto aumenteranno le conoscenze relative a diverse condizioni patologiche, quali l’insufficienza renale acuta e la fibrosi renale, e potranno servire per sviluppare nuovi farmaci in grado di ripristinare le condizioni fisiologiche.

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