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NEFROLOGIA TRASLAZIONALE

 

 


 

  Responsabile:   Personale (qualifica):
  Prof. Giovambattista Capasso   Anna Iervolino, Post doc
Federica Petrillo, Post doc
Luigi De La Motte, Post doc
Vincenzo Costanzo, dottorando
Mariavittoria D’acierno, dottoranda
Yoko Suzumoto, dottoranda
Annalisa Brigida, dottoranda
Luciano D’apolito, dottorando
Sabrina Siccardi, dottoranda

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aree di ricerca
L’obiettivo del laboratorio di Nefrologia Traslazionale è approfondire la conoscenza sulla fisiopatologia renale in modo da sviluppare successivamente nuovi target terapeutici. Gli attuali interessi di ricerca del nostro laboratorio sono indirizzati allo studio dell’ipertensione arteriosa, del diabete mellito, del diabete insipido, delle sindromi poliuriche, della tossicità renale dei farmaci, delle malattie cistiche renali e dei modelli di insufficienza renale acuta, nonché delle patologie renali rare. Per poter condurre queste tematiche di ricerca nel laboratorio di Nefrologia Traslazionale vengono utilizzati sia modelli animali geneticamente modificati, in cui vengono riprodotti la patologia renale o le sue alterazioni, sia modelli murini in cui viene indotto lo stato patologico grazie all’utilizzo di sostanze nefrotossiche. Tali modelli animali rappresentano un valido strumento per riprodurre e studiare le patologie renali, permettendo cosi lo sviluppo di molecole ad azione farmaceutica che in caso favorevole potranno essere utilizzate in campo umano.

 

Tecnologie utilizzate/sviluppate
Per poter raggiungere gli obiettivi sopra menzionati vengono utilizzati studi in vivo e in vitro.


- Parametri metabolici di base: topi o ratti vengono posti individualmente in gabbie metaboliche che permettono, dopo 3 giorni di adattamento, di monitorare il consumo di acqua e cibo, la misurazione di elettroliti (Na, Cl, Ca, K, Mg) e proteinuria in seguito a prelievo di urina e di ematocrito e metaboliti ematici (pH, pO2, pCO2, HCO3) in seguito a prelievo di sangue arterioso o venoso.

- Valutazione istologica della morfologia renale: reni di topo o ratto vengono raccolti in seguito a perfusione renale con paraformadeide tramite aorta addominale e successivamente inclusi in paraffina e tagliati in sezioni sottili per la valutazione morfologica dell’organo o dell’espressione di alcune proteine attraverso saggi di immunoistochimica

- Dissezione macroscopica e microscopica dei distretti renali: una volta raccolti, i reni vengono decapsulati e dissezionati in modo da ottenere una porzione di corticale, una di midollare esterna e una di midollare interna. I differenti segmenti del nefrone (glomerulo, tubulo prossimale, ansa di henle, tubulo distale e dotto collettore) possono essere isolati digerendo la porzione renale di interesse con una soluzione contenente collagenasi e proteinasi. I tubuli renali cosi isolati permettono una efficiente estrazione di RNA e proteine.

- Micropuntura renale: è una metodica altamente specializzata che consente la valutazione del flusso renale direttamente nelle singole porzioni del nefrone. Grazie all’utilizzo di micropipette viene iniettato un liquido di perfusione a monte del tubulo di interesse, tale liquido viene poi raccolto a valle del segmento renale e analizzato. Da queste analisi si ottengono informazioni sul flusso renale del tubulo studiato, sull’entità di assorbimento e di secrezione, nonché sui meccanismi indotti da eventuali farmaci iniettati.

- Microscopia a due fotoni: è la tecnica d’elezione per studi di fisiopatologia in organi di animali viventi, a livello cellulare e sub-cellulare, che consente un’acquisizione simultanea in tempo reale di diversi parametri fisiologici. In campo nefrologico, la microscopia a due fotoni permette di approfondire la conoscenza di molte patologie, tra cui l’insufficienza renale acuta, l’ipertensione o il diabete mellito, grazie alla possibilità di utilizzare sonde fluorescenti che permettono continue misurazioni in tempo reale. In seguito alla esternalizzazione del rene, l’animale viene posizionato sotto al microscopio a due fotoni e i compartimenti renali di interesse vengono marcati tramite accesso venoso con specifiche sonde fluorescenti. L’analisi degli eventi cellulari registrati in condizioni normali o di patologia può essere effettuata tramite approcci informatici.

 

Principali risultati conseguiti

 

- Cistogenesi in un modello murino cKO per Dicer nel rene in toto
L’inattivazione di Dicer nel modello murino cKO (Dicerflox/flox; Pax8Cre/+) causa a livello renale e tiroideo alterata biogenesi dei miRNA, determinando la formazione di numerose cisti e fibrosi interstiziale nei reni di cKO a due mesi. Dal punto di vista funzionale i cKO manifestano un marcato difetto di concentrazione dell’urina e proteinuria. La formazione delle cisti è correlata ad una graduale scomparsa del cilio primario e si associa ad una alterazione del pathway GSK3β/β-catenina.

- β1 integrina è fondamentale per il processo di concentrazione delle urine
Per studiare la β1 integrina, un recettore che media l’interazione tra cellula e matrice extracellulare, è stato generato un modello murino cKO (Itgb1flox/flox; Pax8 Cre/+) in cui la proteina è deleta in tutto il nefrone. I reni dei topi cKO manifestano marcata idronefrosi e dilatazioni dei tubuli distali, dell’ansa di Henle e dei dotti collettori. Abbiamo inoltre identificato in questi animali una riduzione di espressione del canale AQP2 che ha determinato un forte difetto di concentrazione delle urine.

- miRNA: targets terapeutici per acquaresi
Per indagare il ruolo dei miRNA nei dotti collettori è stato generato un modello murino cKO in cui si ha delezione specifica di Dicer nelle cellule principali (Dicerflox/flox; AQP2+/Cre). In questa porzione del nefrone il canale dell’acqua AQP2 media il processo di concentrazione delle urine, al punto che assenza o mutazioni di questa proteina causano diabete insipido. Abbiamo evidenziato una marcata poliuria in topi cKO di circa due mesi, sviluppo di idronefrosi e morte prematura entro i 3 mesi. È in corso la definizione di nuovi target molecolari in questo processo.

- Plasticità cellulare del dotto collettore come meccanismo di auto-riparazione
Le cellule principali (PC) e quelle intercalate (IC) costituiscono i 2 tipi cellulari del dotto collettore, ed hanno origine da precursori staminali non ben noti. Le cellule intercalate possono mutare il loro assetto da acido a base secretivo, mostrando estrema plasticità. Dalla letteratura si evince che le cellule principali invece possono mutare in cellule intercalate. Abbiamo dimostrato precedentemente che il litio induce la comparsa di tipi cellulari aventi caratteristiche intermedie tra PC e IC.  Abbiamo generato topi esprimenti selettivamente YFP nelle PC per seguirne i cambiamenti morfologici e funzionali durante il trattamento con litio. L’eventuale espressione di marcatori propri delle IC nelle cellule YFP marcate proverebbe l’eventuale conversione delle PC in IC.

- Nuovi target molecolari di ipertensione in un modello di ipertensione sale sensibile (ratti NA)
Polimorfismi dell’alpha adducina sono legati allo sviluppo di ipertensone arteriosa nell’uomo. Stiamo determinando il meccansimo patogenetico che determina lo sviluppo di ipertensione arteriosa in ratti portatori di una mutazione dell’alpha adducina. Da esperimenti preliminari è nota una interazione molecolare tra alpha adducina e il trasportatore Na/Cl tiazide sensibile (NCC). Tale interazione modifica lo stato di fosforilazione e di attivazione di NCC.  

- Applicazione di metodiche molecolari nella diagnostica di patologie genetiche rare
Attualmente nel nostro laboratorio stiamo studiando diverse malattie genetiche rare tra cui la sindrome di Fanconi Bickel, la sindrome di Gitelman e la β-talassemia. Per la valutazione di queste patologie stiamo utilizzando un approccio molecolare innovativo per la validazione di possibili marcatori prognostici su campioni di urine di pazienti affetti.